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食药监总局发布《植物蛋白饮料中植物源性成分鉴定》食品补充检验方法(2017年第75号)
发布时间:2017-6-21 21:17:06

 

   按照《食品补充检验方法工作规定》,《植物蛋白饮料中植物源性成分鉴定》食品补充检验方法已经国家食品药品监督管理总局批准,对外发布。

附件

植物蛋白饮料中植物源性成分鉴定

BJS 201707

1 范围

本方法规定了食品核桃源性成分、花生源性成分、杏仁源性成分、芝麻源性成分、榛子源性成分、大豆源性成分鉴定实时荧光PCR方法。

本方法适用于核桃露(乳)、杏仁露、果仁露等复合植物蛋白饮料中标识含有核桃源性成分、花生源性成分、杏仁源性成分、芝麻源性成分、榛子源性成分、大豆源性成分的检测及鉴定

2 原理

提取试样中基因组DNA,以DNA为模板,利用物种特异性引物及探针进行实时荧光PCR扩增检测,同时设置阳性、阴性及空白对照。根据扩增的Ct值,判定试样中是否含有该源性成分。

3试剂和材料

除另有规定外,试剂为分析纯或生化试剂。实验用水符合GB 6682的要求。所有试剂均用无

DNA酶污染的容器分装。

3.1核桃源性成Jugr2基因检测用引物序列为:

核桃5’端引物:5’-CGCGCAGAGAAAGCAGAG-3’

核桃3’端引物:5’-GACTCATGTCTCGACCTAATGCT-3’

核桃探针:5’-FAM-TTGTGCCTCTGTTGCTCCTCTTCCC-TAMRA-3’

3.2花生源性成分Ara b2基因检测用引物(对)序列为:

花生5’端引物:5’-GCAACAGGAGCAACAGTTCAAG-3’

花生3’端引物:5’-CGCTGTGGTGCCCTAAGG-3’

花生探针:5’-FAM-AGCTCAGGAACTTGCCTCAACAGTGCG-Eclipse-3’

3.3 杏仁源性成分Prudul基因检测用引物(对)序列为:

杏仁5’端引物:5’-TTTGGTTGAAGGAGATGCTC-3’

杏仁3’端引物:5’-TAGTTGCTGGTGCTCTTTATG-3’

杏仁探针:5’-FAM-TCCATCAGCAGATGCCACCAAC- Eclipse-3’

3.4芝麻源性成分2S albumim mRNA基因检测用引物(对)序列为:

芝麻5’端引物:5’-CCAGAGGGCTAGGGACCTTC-3’

芝麻3’端引物:5’-CTCGGAATTGGCATTGCTG-3’

芝麻探针:5’-FAM-TCGCAGGTGCAACATGCGACC- TAMRA-3’

3.5榛子源性成分oleosin基因检测用引物(对)序列为:

榛子5’端引物:5’-CCCCGCTGTTTGTGATAT-3’

榛子3’端引物:5’-ATGATAATAAGCGATACTGTGAT-3’

榛子探针:5’-FAM-TCCCGTTCTCGTCCCTGCGGT- Eclipse-3’

3.6大豆源性成分Lectin基因检测用引物(对)序列为:

大豆5’端引物:5’-GCCCTCTACTCCACCCCCA-3’

大豆3’端引物:5’-GCCCATCTGCAAGCCTTTTT-3’

大豆探针:5’-FAM-AGCTTCGCCGCTTCCTTCAACTTCAC- TAMRA-3’

3.7真核生物18SrRNA内参照检测用引物(对)序列为:

内参照5’端引物: 5’-TCTGCCCTATCAACTTTCGATGGTA-3’

内参照3’端引物: 5’-AATTTGCGCGCCTGCTGCCTTCCTT-3’

内参照探针:5’-FAM-CCGTTTCTCAGGCTCCCTCTCCGGAATCGAAC- TAMRA-3’

3.8 CTAB缓冲液:55 mmol/L CTAB1400mmol/L NaCl20 mmol/L EDTA100 mmol/L Tris

10%盐酸调节pH 8.0121高压灭菌20 min, 备用。

3.9 蛋白酶K20mg/mL

3.10苯酚:氯仿:异戊醇(体积比:25:24:1)。

3.11 异丙醇。

3.12 70%乙醇。

3.13 Taq DNA聚合酶。

3.14 dNTP混合液。

3.15 TE缓冲液(Tris-HClEDTA缓冲液):10mmol/L Tris-HClpH8.0),1 mmol/L EDTApH8.0)。

3.16 10×PCR缓冲液:200 mmol/L KCl15 mmol/L MgCl2200 mmol/L Tris-HClpH8.8)。

4仪器和设备

4.1 组织研磨器。

4.2 核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。

4.3 恒温水浴锅。

4.4 离心机:离心力12,000g

4.5 微量移液器(0.5μL~10μL10μL~100μL10μL~200μL100μL~1000μL)。

4.6 实时荧光PCR仪。

4.7 涡旋振荡器。

4.8 天平:感量0.01g

5分析步骤

5.1 试样DNA提取

固体样品:将样品粉碎后称取0.3~0.6 g,按下列方法提取DNA。也可用等效商品化DNA提取试剂盒提取DNA

样品:取1 mL 样品于Eppordorf管中,加入1 倍体积的异丙醇,混合均匀,室温下沉淀5 min,室温下以12,500 rpm 离心5 min,弃去上清液重复操作一次所得的沉淀用于提取DNA。可按下列方法提取DNA,也可用等效商品化DNA提取试剂盒提取DNA

1处理后的样品加入2 mL离心管中,加入600 μL CTAB缓冲液和40 μL蛋白酶K溶液,振荡混匀,65孵育1 h过夜孵育更好, 期间每隔10 min振荡混匀;

2)加入500 μL的苯酚:氯仿:异戊醇(25:24:1),振荡抽提10 min,室温下以12,500 rpm 离心10 min

3)小心吸取上清液,加入等体积的异丙醇,振荡均匀,12,500 rpm 离心10 min

4)弃去上清液,用65预热的TE缓冲液溶解DNA

5)小心吸取上清,加入200 μL氯仿:异戊醇(24:1),振荡抽提,室温下以12500 rpm 离心15 min

6)小心吸取上清液,加入等体积的异丙醇,振荡均匀,12,500rpm 离心10 min

7)弃去上清液,沉淀用70% 乙醇洗涤,离心1min,晾干,溶于50μLTE 缓冲液中。

5.2 DNA浓度和纯度的测定

1μL DNA溶液,使用核酸蛋白分析仪检测其浓度及质量,OD260/2801.7~1.9之间时,适宜于PCR扩增。

5.3 实时荧光PCR扩增

反应体系总体积为25μL,其中10×PCR缓冲液5μL,正反向引物(10μmol/L)各1μL,探针(10μmol/L1μLdNTPs10μmol/L2μL Taq DNA聚合酶(2.5U0.2 μLDNA模板(10-100ng/μL2μL,用灭菌去离子水补足至总体积25μL。真核生物内参照的反应体系同上,仅替换相应的引物和探针。也可使用相应的商品化扩增试剂盒。

反应参数:50 2min95 15min95 15s 60 1min 40个循环。

5.4 实验对照

检验过程分别设阳性对照、阴性对照、空白对照。以相应植物源物种提取的DNA为阳性对照,以已知不含该植物源的物种DNA为阴性对照,以灭菌水为空白对照。样品、内参照和对照设置两个平行的反应体系。

6结果判断与表述

6.1 质量控制

以下条件有一条不满足时,结果视为无效:

(a)空白对照:无FAM荧光信号检出;

(b)阴性对照:无FAM荧光信号检出;

(c)阳性对照:有FAM荧光信号检出,且FAM通道出现典型的扩增曲线,Ct≤35.0

 (d)内参对照:有荧光对数增长,且荧光通道出现典型的扩增曲线,相应的Ct值<30.0

6.2 结果判定

(a)Ct≤35.0,则判定为被检样品阳性;

(b)Ct≥40.0,则判定为被检样品阴性;

(c)35.0Ct值<40.0,则重复试验一次。如再次扩增后Ct值仍为35.0Ct值<40.0,则判定被检样品可疑

6.3 结果表述

结果为阳性者,结合产品标识,表述为检出XX源性成分

结果为阴性者,结合产品标识,表述为未检出XX源性成分

结果为可疑者,结合产品标识,表述为XX源性成分可疑”。

7防污染措施

检测过程中放置交叉污染的措施按照GB/T 27403中的规定执行。

本方法负责起草单位:河北省食品检验研究院。

验证单位中国食品药品检验研究院、北京市食品安全监控和风险评估中心、湖北省食品质量安全监督检验研究院、武汉食品化妆品检验所、河北出入境检验检疫局检验检疫技术中心、中国肉类食品综合研究中心。

主要起草人:周巍、王爽、章晶晶、崔生辉、李永波、孙勇。


 

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